Нечасто возникает ситуация, когда за разработку технологии научного исследования, которое потом широко применяется в клинической практике, автор получает Нобелевскую премию. Но именно так произошло с Кэрри Муллисом, который в 1993 году получил Нобелевскую премию по химии. Итогом его многолетних исканий явился метод полимеразной цепной реакции или ПЦР. Что это такое? Почему этот способ изучения молекулярных структур так широко стал применяться в медицине, хотя в науке он считается экспериментальным способом? Чтобы разобраться в этом, нужно вспомнить, что такое геном.
Что такое геном?
Известно, что каждое живое существо на планете обладает определенным набором наследственной информации, которая передается от поколения к поколению. У человека это информация зашифрована в 46 хромосомах, у других живых существ, как животных, так и растений, существует иное количество хромосом. Но в каждой хромосоме содержатся очень компактно скрученные нити ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислоты, которая является гигантской молекулой «биологической памяти».
Именно молекула ДНК хранит закодированную информацию о структуре живой ткани, а точнее — о белках, которые должны синтезироваться. По сути, ДНК представляет собой матрицу, на которой один за другим располагаются участки, отвечающие за синтез отдельных белков. У каждого живого существа есть свои собственные, уникальные участки этой молекулы, которые не встречаются у другого вида: белки строго видоспецифичны, а их определенная последовательность также уникальна. Как же можно воспользоваться этой структурой в диагностических целях?
В том случае, если проводится анализ крови ПЦР методом, то можно выделить наследственный материал тех живых существ, которые оставили свои следы в организме человека. Конечно, прежде всего, это возбудители различных инфекционных заболеваний: вирусы и бактерии, грибы и простейшие, другие патогенные формы жизни.
Вся сложность состоит в том, что если в организм человека попало определённое количество возбудителей, например, бактерий, и организм их уже успела разрушить, то в плазме крови сохраняются незначительные обрывки наследственной информации.
Эти обрывки и остатки содержат, в том числе, фрагменты тех самых уникальных последовательностей ДНК, но их нужно каким-то образом сделать узнаваемыми. Как же получить выявляемые участки генома, которые можно подвергнуть дальнейшему исследованию, и дать ответ, находится ли данный возбудитель в организме, или его остатки? Для этого и разработан метод полимеразной цепной реакции, или анализ крови на ПЦР в медицине. В чём суть метода?
Что такое полимеразная реакция?
Полимераза — это особый фермент, который в соответствующих условиях может многократно умножать, или амплифицировать заданный участок ДНК, копируя его много раз. Этот метод напоминает человека, который вошел в темную комнату с зеркальными стенами, и зажег в ней фонарик. Многократное отражение луча от стен делает комнату светлой, хотя луч из фонарика по-прежнему выходит один. Также и фермент ДНК полимераза, позволяет многократно увеличить количество наследственного материала, делая его концентрацию доступной для определения.
Сама технология этой реакции — достаточно тонкий процесс. В начале необходимо задать точную температуру, которая измеряется десятыми долями градусов. Материал, в котором, возможно, находится наследственный материал возбудителей, нагревают до высокой температуры, чтобы разрушить водородные связи внутри двухцепочечной структуры ДНК.
Затем добавляется в раствор ДНК полимераза, особые праймеры, которые крепятся к свободным концам фрагментов ДНК, откуда и начинает работать полимераза, туда же добавляются нуклеотиды — аденин, гуанин, цитозин и тимин, и проводятся определенный технологические процедуры. В результате на выходе образуется гораздо больше копий с заданными параметрами, чем на входе этой реакции. Если ДНК полимераза успешно справилась с заданием, то многократно умноженный и достроенный фрагмент сверяется с необходимой базой данных, и затем делается заключение о наличие в организме определённого возбудителя.
Где еще применяется ПЦР?
Читайте также:
Не стоит думать, что анализ крови на ПЦР и применение ее в медицине является единственным. Различных способов исследовать наследственный материал методом ПЦР существует много. Насчитывается более 10 разновидностей полимеразной цепной реакции, например, инвертированная, ступенчатая, с обратной транскрипцией, ПЦР длинных фрагментов, и даже виртуальная ПЦР. Последняя разновидность есть не что иное, как математический метод компьютерного моделирования, который проводится для предсказания достоверности будущих реакций.
В современной практике полимеразная цепная реакция с успехом применяется в криминалистике, если на месте преступления оставлены биологические материалы. Если есть подозреваемый, то нет никаких проблем с идентификацией принадлежности материала конкретному лицу.
ПЦР диагностика помогает выявить отцовство, а также применяется для клонирования генов, которая необходима в современной медицине для создания моноклональных антител. Они перспективны как способ лечения лечения злокачественных новообразований, рассеянного склероза, и многих аутоиммунных болезней. Также это реакция применяется в генетике для секвенирования ДНК, а также для экспериментального мутагенеза, или внесения необходимых исследователям изменений в избранный геном.
Применение в медицине
Расшифровка анализа крови, выполненного методом ПЦР, позволяет быстро и с высокой достоверностью определить наличие в организме пациента возбудителей очень многих заболеваний, которые не растут на искуственных средах. Чаще всего к ним относятся различные вирусы и «капризные» микроорганизмы. Это вирусы папилломы и клещевого энцефалита, цитомегаловирусная инфекция и туберкулез, вирусные гепатиты и мононуклеоз, герпетическая инфекция и ВИЧ-инфекция, микоплазменная и хламидийная инфекция.
Что показывает анализ? Практически всегда он выполняется качественно, и в заключении дается ответ, есть в образце наследственный материал определенного возбудителя, или его нет, человек заражен, или инфицирования не выявлено. Иногда проводится количественное определение, но оно выполняется реже и стоит дорого дороже.
Большим преимуществом является то, что сдавать кровь на ПЦР вполне можно безо всякой подготовки, в отличие от изучения многих биохимических показателей. Кровь сдается, как обычно, без сложностей. В начале XXI века метод ПЦР — золотой стандарт диагностики различных инфекций. Но, как и у любого способа, у метода ПЦР имеются плюсы и минусы.
Плюсы и минусы
Безусловными плюсами этого метода является широкая универсальность. Он может обнаружить очень многих возбудителей, исследовать можно любой биоматериал, от соскобов и до биоптатов тканей, от крови и слюны до мочи и спермы. При необходимой подготовке в одном образце можно сразу поставить реакцию на выявление нескольких возбудителей, провести групповое определение.
Метод ПЦР очень чувствительный, и даже если в исследуемом образце находится всего лишь несколько обрывков ДНК, то можно определить даже раннюю стадию заболевания, включая даже день заражения. Это реакция показана для выявления латентной инфекции, которая никак себя не проявляет, в том числе, если у пациента на фоне иммунодефицита не синтезируются антитела.
Метод ПЦР позволяет проводить быструю диагностику, и уже на следующий день после сдачи анализов получить результат. Наконец, ПЦР — диагностика отличается высокой достоверностью, точностью, и, как показала практика, небольшой стоимостью. Последнее качество очень важно, поскольку при поиске различных инфекций пациенту приходится платить сразу за постановку реакций для поиска нескольких возбудителей. Поэтому количество ПЦР-исследований в каждой крупной лаборатории очень велико.
Но не существует совершенных методов исследования. Следует помнить, что далеко не каждая лаборатория может себе позволить проведение анализов ПЦР. Необходим специальный прибор, в котором ставится реакция, и он называется амплификатор. Профессионализм специалистов лаборатории должен быть очень высоким, соблюдение технологии — безукоризненным, а чистота в лаборатории должна быть абсолютной. Также предъявляются высокие требования к чистоте и исходного образца. В том случае, если берется кровь, то необходимо тщательно обработать кожу, иначе в кровь могут попасть частицы микроорганизмов, которые находятся на ее поверхности. Это же относится и к другим образцам, например, смывам из носоглотки, или к вагинальным мазкам.
